Svolta microscopia elettronica: le immagini delle proteine più piccole del nostro corpo

I fisici introducono il contrasto di fase nella microscopia elettronica, potenzialmente rivoluzionando la  criomicroscopia elettronica.

 

 

 

Quasi 100 anni fa, una scoperta apparentemente semplice rivoluzionò il microscopio.

L’introduzione del contrasto di fase, che valse un Premio Nobel nel 1953, mise in luce strutture all’interno delle cellule che in precedenza erano troppo sbiadite o sbiadite per essere studiate dai biologi.

I fisici dell’UC Berkeley hanno ora adattato la tecnica del contrasto di fase al microscopio elettronico, che ha circa 10.000 volte l’ingrandimento dei microscopi che utilizzano luce ottica.

L’aggiunta di una cosiddetta piastra di fase laser ha il potenziale di migliorare notevolmente la criomicroscopia elettronica (crio-EM), una tecnica per determinare la struttura delle molecole che a sua volta ha rivoluzionato la comprensione delle proteine e accelerato la scoperta di nuovi farmaci a partire da dieci anni fa.

Nonostante il suo impatto, tuttavia, la crio-EM fatica ancora a produrre immagini chiare di piccole molecole — inclusa la maggior parte delle proteine umane.

Una piastra laser a fase promette immagini chiare della maggior parte delle proteine nella cellula fino a un terzo delle dimensioni di quelle che rappresentano una sfida per le macchine odierne.

L’aggiunta di una piastra di fase laser sembra destinata a rivoluzionare una tecnica più recente nota come crioelettronica tomografia (cryo-ET), che assembla diverse viste angolari di una molecola o proteina in un’immagine 3D.

Questo rende possibile analizzare le proteine nel loro ambiente naturale — all’interno delle cellule — invece che isolatamente in una soluzione.

“La cryo-EM è diventata il nuovo metodo in più rapida crescita per risolvere la struttura delle macromolecole biologiche, e si prevede che la cryo-ET mostri come queste molecole lavorano insieme nel loro contesto naturale e cellulare”, ha detto Holger Müller, professore di fisica all’UC Berkeley e scienziato presso il Lawrence Berkeley National Laboratory che ha guidato lo sforzo di sviluppo.

“Ma a causa delle limitazioni segnale-rumore, la maggior parte delle proteine umane e animali è troppo piccola per essere analizzata con questi metodi. L’aumento del rapporto segnale-rumore fornito da questa piastra di fase laser dovrebbe superare queste importanti limitazioni.”

Cruciale per lo sviluppo è il laser a onda continua più intenso e focalizzato al mondo, che interagisce con il fascio di elettroni per cambiarne la fase.

Questo cambiamento di fase aumenta il contrasto per le piccole molecole, come l’emoglobina, e per molecole e strutture all’interno delle cellule, come il nucleo e i mitocondri.

“Con la crio-ET, stiamo osservando materiale cellulare piccolo e molto complesso che è incredibilmente affollato all’interno della cellula”, ha detto Bridget Carragher, direttrice tecnica fondatrice dell’imaging presso Biohub a Redwood City, California.

“È come una foresta di alberi, e stai cercando di trovare una foglia su un albero lì dentro. La crio-ET necessita di un passo avanti drammatico rispetto al confronto, così possiamo iniziare a vedere cosa succede all’interno della cellula. È quello che la piastra di fase laser promette di darci.”

Biohub fornì finanziamenti a Müller per acquistare una macchina crio-EM all’avanguardia che poi equipaggiò con una piastra di fase laser, creando un microscopio che chiamò Theia, così chiamato in onore dell’antica Titanessa greca della luce e della radianza.

Carragher sta supervisionando lo sviluppo di uno strumento simile nel laboratorio di imaging di Biohub a Redwood City — questo con un sistema a doppio laser, basato sul lavoro teorico di Müller e dei suoi colleghi. In questo sistema, i due fasci laser perpendicolari operano a circa metà potenza, rendendo i componenti meno propensi a bruciarsi e riducendo le aberrazioni.

Entrambi i gruppi stanno collaborando con la società Thermo Fisher Scientific, il principale produttore di macchine crio-EM.

“Theia è il microscopio della Formula 1,” ha detto Müller. “Ha ottiche elettroniche extra che gli conferiscono una risoluzione migliore rispetto al crio-EM standard, anche senza il laser. Con l’aggiunta della piastra di fase laser, speriamo che diventi davvero il miglior strumento al mondo in assoluto.”

Müller e il suo team di Berkeley pubblicheranno le loro immagini e dettagli più recenti della piastra di fase laser del crio-EM nel numero dell’11 giugno della rivista Science. Il sistema a due laser di Biohub è descritto in un preprint pubblicato di recente.

Le cellule animali e vegetali sono per lo più acquee e quindi trasparenti al microscopio ottico, il che dovrebbe rendere facile vedere strutture come il nucleo e i mitocondri all’interno.

Ma queste strutture sono piccole e diffondono solo una piccola quantità di luce, il che le rende solo leggermente più scure rispetto al resto dell’interno della cellula. Q

uesto basso contrasto è stato tipicamente migliorato colorando la cellula, anche se la colorazione uccide anche la cellula.

Nel 1930, lo scienziato olandese Frits Zernike si rese conto che la luminosità o l’ampiezza della luce non era l’unica caratteristica interessata nel passaggio attraverso una cellula.

La luce diffusa viene anche rallentata in un campione biologico, che ne sposta la fase — il momento del picco della forma d’onda — di una piccola quantità.

Sebbene questo sfasamento sia invisibile all’occhio umano, può essere trasformato in contrasto visibile spostando anche di 90 gradi la luce non diffusa.

Quando la luce diffusa e non diffusa sono infine focalizzate sulla retina, le caratteristiche nel campione vengono accentuate rispetto allo sfondo, aumentando il contrasto. Zernike ricevette il Premio Nobel per la Fisica nel 1953 per questa scoperta.

All’inizio degli anni ’40, il microscopio a contrasto di fase aveva dimostrato il suo valore e gli scienziati ipotizzarono di adattare questa tecnica per aumentare il contrasto nel microscopio elettronico, che utilizza un fascio di elettroni per visualizzare strutture molto più piccole, come le proteine.

Ma i tentativi di creare una piastra di fase che spostasse la fase di un fascio di elettroni ridussero troppo l’intensità del fascio, rendevano le immagini instabili o portavano a una risoluzione inferiore.

Nel 2010, Müller e Robert Glaeser, ora professore emerito di biologia molecolare e cellulare a Berkeley, hanno scritto un articolo proponendo un modo per creare lo sfasamento utilizzando un laser intenso, che non avrebbe attenuato il fascio di elettroni.

Glaeser è un pioniere della crio-EM, un importante miglioramento nella microscopia elettronica e teoricamente un metodo più semplice per determinare le strutture molecolari rispetto alla cristallografia a raggi X, che richiede che una molecola formi effettivamente un cristallo e che il ricercatore abbia accesso a una sorgente luminosa di raggi X.

Ma un problema importante della microscopia elettronica è che il fascio di elettroni si riscalda e alla fine danneggia il bersaglio, limitando i dettagli dell’immagine.

Rivestire il campione con metallo per prevenire questo e aumentare il contrasto rende solo immagini più sfocate.

Negli anni ’60, gli scienziati proposero di congelare i campioni per rallentare la distruzione dei campioni.

Glaeser dimostrò che il congelamento dei campioni riduceva i danni da radiazione e propose di ridurre ulteriormente i danni abbassando la potenza del fascio di elettroni mentre irradiava simultaneamente migliaia di molecole congelate.

Sebbene ogni molecola nel campione fosse in un orientamento casuale, i computer potevano combinare tutte le immagini per creare una struttura altamente dettagliata.

Gli ideatori della crio-EM hanno ricevuto un Premio Nobel per la Chimica nel 2017 e, nelle loro dichiarazioni di accettazione, hanno accreditato il lavoro di Glaeser. Secondo il Comitato Nobel, la crio-EM “semplifica e migliora sia l’imaging delle biomolecole. Questo metodo ha portato la biochimica in una nuova era.”

Dopo la pubblicazione dell’articolo del 2010, Müller ha trascorso 15 anni a realizzare l’obiettivo di una piastra a fase laser per la crio-EM, finanziata in parte da una sovvenzione dei National Institutes of Health.

Per prima cosa, lui e il suo team dovevano sviluppare un modo per mettere a fuoco un laser continuo su un piccolo punto per creare una luce abbastanza intensa da spostare la fase di un fascio di elettroni di 90 gradi.

Dopo 10 anni, sono riusciti a intrappolare il fascio laser in una cavità sferica e specchiata che sia focalizza il fascio sia lo intensifica mentre la luce rimbalza avanti e indietro più di 10.000 volte.

“Sono 75 kilowatt concentrati su pochi micron,” ha detto Müller. “È più potente di quello che usi per saldare. È più potente di un laser militare. Costruisce il focus laser continuo più luminoso di sempre.”

Hanno dimostrato che il concetto funzionava installando una piastra di fase laser in uno dei vecchi microscopi di Glaeser, ma i finanziamenti di Biohub hanno poi permesso loro di acquistare un microscopio crio-EM Thermo Fisher Krios personalizzato e all’avanguardia e riinstallarlo.

Nel nuovo articolo, dimostrano che il potente fascio laser focalizzato produce immagini ad alta risoluzione per sei campioni diversi di dimensioni diverse e preparazioni di campioni differenti.

“Per i casi più difficili — particelle piccole, campioni difettosi — il laser produce un vantaggio molto considerevole,” ha detto Müller.

Nel loro articolo mostrano immagini ricostruite di una proteina proveniente dal muscolo chiamata aldolasi, relativamente facile da fotografare con le macchine crio-EM odierne, e per l’emoglobina — una proteina che trasporta ossigeno nel sangue — che è al limite inferiore per le macchine attuali.

La piastra di fase laser ha migliorato la risoluzione della struttura proteica in entrambi i casi, ma ancora di più per la molecola più piccola, l’emoglobina.

“In definitiva, se hai una proteina grande e un campione davvero buono — uno fresco o uno congelato senza bolle, ad esempio — potresti non aver bisogno della piastra di fase per ottenere un’immagine singola e di alta qualità. Ma per una proteina piccola e un campione cattivo, il laser è la scelta migliore,” ha detto Müller.

“Questo potrebbe colmare un enorme vuoto nella nostra conoscenza delle strutture proteiche che non possono essere cristallizzate o che sono troppo piccole per la crio-EM di oggi. E sarà rivoluzionario per la crio-ET.”

La dimensione delle proteine si misura in dalton — così chiamati così in onore del chimico inglese John Dalton e equivalenti a 1/12 della massa di un atomo di carbonio-12 — e oggi la crio-EM riesce a malapena a visualizzare proteine inferiori a 70 kilodalton, che costituiscono circa il 90% del proteoma umano.

Con la piastra di fase laser, ora è possibile — anche se difficile — ottenere immagini fino a 50 kilodalton (anche più piccole dell’emoglobina).

Presto, Müller spera, questo valore sarà portato a 17 kilodalton (la dimensione della proteina mioglobina).

È ottimista sul fatto che ciò possa essere ottenuto con un fascio di elettroni focalizzato, a differenza di un fascio sfocato, che ora senza la piastra di fase laser è necessario per ottenere qualsiasi contrasto.

Questo vantaggio sarebbe un altro vantaggio della piastra di fase laser e fornirebbe un ulteriore aumento di un fattore di due nel contrasto e nel rapporto segnale-rumore, oltre a quello già raggiunto.

Una piastra di fase laser dovrebbe essere in grado di estrarre il contrasto dai cambiamenti di fase solo nel fascio di elettroni focalizzato, ha detto.

“Questa tecnologia rappresenta un cambiamento graduale di funzione per la biologia”, ha detto Stephani Otte, Vicepresidente della Scienza dell’Imaging di Biohub.

“Potremo vedere come le macchine molecolari operano all’interno della cellula vivente, nel contesto, per la prima volta. Ciò che una volta era invisibile diventerà visibile — e questo cambia tutto su come comprendiamo la malattia.”

 

Immagine: Sayo Studio